浅谈胶原蛋白的检测

一个成年人体内大约有3kg的胶原，主要存在于皮肤、肌肉、骨骼、牙齿、眼睛等部位，在筋腱和骨头的有机质中占90%以上。胶原有很多种类型，按照所发现的先后顺序分别被命名为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型胶原等，目前已被人类认知的有27种胶原。如何检测胶原及其类型，对于胶原的分离、提取、纯化及其制品的使用和对临床上判断器官的病理变化都具有非常重要的意义。

胶原或胶原蛋白的检测包括定性分析和定量分析，涉及到三个层次：

到目前为止，一般都是用组织化学染色法来鉴定组织中的胶原，方法很多，常用的检测方法为VanGieson染色法和苦味酸-天狼猩红染色-偏振光法，前者只适用于疏松结缔组织的胶原。

组织化学染色法是基于胶原分子富含碱性氨基酸，常可与酸性染料起强烈反应。酸性品红是含有三个磺酸基的酸性染料，呈紫红色，能与胶原发生染色化学反应;此外，组织的上色还与染料分子的大小及组织的渗透性有关，而组织的渗透性取决于组织的结构密度。不同的组织细胞成分，空隙大小不同。空隙小，组织结构致密，其渗透性较小，因此需选择相对分子质量小的染料进行染色：空隙大，组织结构疏松，相应的渗透性大，染料的渗透不受相对分子质量的限制，由于酸性品红的相对分子质量较大，所以只适合于结构比较疏松、组织渗透性较大的疏松结缔组织的胶原纤维染色。

胶原或胶原蛋白的定量分析有多种方法对于已知是胶原或胶原蛋白的样品，凯氏定氮法是最可靠的，其次可用双缩脲法、紫外分光光度法、Folin-酚法和考马斯亮蓝G-250染色等。

原理：凯氏定氮法是通过测定试样的含氮量来换算蛋白质的含量。试样在催化剂的存在下，用硫酸加热分解有机物，使试样中的含氮物转变成硫酸铵，再加人浓氢氧化钠溶液蒸馏，硫酸铵与氢氧化钠反应生成氢氧化铵，氢氧化铍受热分解为氨和水，氨被蒸出，由硼酸吸收，再用酸滴定，计算出含氮量，乘以氮与蛋白质的换算系数6.25计算出蛋白质含量，有人认为胶原蛋白的换算系数应该用5.54。

原理：具有2个以上的酰胺键(肽键)的化合物在碱性溶液中能与铜离子发生缩脲反应生成紫色配合物，其色泽深浅与该化合物的含量成正比，可以比色定量。蛋白质分子链中含有众多的肽键，因此可用双缩脲反应来对蛋白质进行定量，且与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。

由于胶原广泛参与细胞的分化、增殖，机体的运动和衰老等各种生命活动，尤其是现在发现有些病变(如肝纤维化、糖尿病肾病、骨质疏松等)，在病变部位或血清、尿液中有相应的胶原数量的变化，所以对相关组织、血清、尿液等快速鉴定提出了新的要求。近20年来，免疫学检测法越来越受到重视，而且发展也很快，已有多种检测方法。

胶原类型众多，在遗传基因水平上有所不同，有很多抗原决定簇，包括氨基酸顺序决定簇、伸延部决定簇和螺旋决定簇。螺旋决定簇的抗体只与天然胶原起反应而不与只有顺序而无螺旋特性的热变性胶原反应。

实验证明，螺旋抗体具有类型的特异性，不会发生交叉，这具有免疫学的理论根据。

现在，已能制备特异性强、效价高的抗各种型别胶原的特异性抗体，因此可以通过免疫组织学方法，检测各种组织中多种类型的胶原的分布及病变时各型胶原的变化。

免疫组织化学技术是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂(如酶、金属离子、同位素等)显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的一门新兴组织化学技术。

免疫组织化学是组织化学吸收了免疫学的理论和技术发展起来的一门方法学，在现代生物学领域中广泛应用，也是胶原检测的重要手段。

胶原的一个特点是含有大量的特异性氨基酸，即轻脯氨酸(HYP)利马储氨酸(HYL)，且含量比较稳定。除了弹性蛋白、伸展蛋白及乙酰胆碱脂酶等成分中也存在一些羟脯氨酸外，一般的蛋白质中，不存在这些特异性氨基酸。因此，对胶原总量的测定，常用水解后羟脯氨酸的含量来表示。此法不如免疫法可测定μg级、ng级甚至pg级，只能测至mg级，也不能区分胶原的类型。测定羟脯氨酸有多种方法，对于羟脯氨酸含量高的样品，可用操作简便的Woessner法；对于羟脯氨酸含量少的样品，如组织的水解物、尿的水解物等，则需用操作较为复杂的Kivirikko等的方法。此外，也可采用氨基酸分析进行定量测定胫脯氨酸和羟赖氨酸。

胶原或胶原蛋白完全水解，成为混合氨基酸。这种混合氨基酸的组成有其自身的特点和基本组成。

目前普遍使用氨基酸分析仪来测定蛋白质水解液中的氨基酸，但对胶原蛋白使用较少。

蒋挺大等在20年前就使用氨基酸分析仪来测定胶原蛋白的氨基酸。发现酸水解的控制、水解用的是盐酸还是硫酸、浓度多大、水解多长时间、如何后处理，都对测定结果有直接的影响。

张林生等研究了胶原水解液的氨基酸分析，系统试验了双柱分析方法，以及新的缓冲液的配制。他们认为增大缓冲液的pH值，氨基酸可以提前洗脱；降低缓冲液的pH值，氨基酸洗脱将被延迟。胱氨酸和赖氨酸对缓冲液pH值很敏感，pH3.50缓冲液使胱氨酸的分离位于丙氨酸与缬氨酸之间；pH5.20缓冲液使赖氨酸位于羟赖氨酸与组氨酸之间;若缓冲液更换时间不当，会使赖氨酸与羟赖氨酸两个峰分不开，影响分离结果。他们用Beckman 121 MB型氨基酸分析仪对胶原水解氨基酸的分析重复性有满意的结果。

关于胶原的相关检测科研人员还在不断进行着研究，目前国内已形成了一些用于胶原产品的检测标准，小编帮助大家搜索列举一些：

参考书籍：本文摘自《胶原与胶原蛋白》（蒋挺大主编） ；部分内容参考《胶原物理与化学》（汤克勇主编）。

特别声明：本文转载内容仅仅是出于科普传播信息的需要，并不意味着代表本网站观点或证实其内容的真实性；如其他媒体、网站或个人从本网站转载使用，须保留本网站注明的“来源”，并自负版权等法律责任；作者如果不希望被转载或其它相关事宜，请与我们接洽。